农业农村部公告第717号-1-2023 鸡传染性支气管炎活疫苗中非法添加改变制苗用毒种检测方法.pdf
文档页数：5文档大小：1.42MB文档格式：pdf附件1 鸡传染性支气管炎活疫苗中非法添加/ 改变制苗用毒种检测方法 1.适用范围 1.1本方法适用于鸡传染性支气管炎活疫苗中非法添加/改 变制苗用毒种的检测. 1.2非法添加/改变制苗用毒种的检测范围为GI-1谱系 (Mass-like)、GI-13谱系(4/91-like)、GI-19谱系(QX-like)和GI- 22谱系(LDT3-A-like)的鸡传染性支气管炎病毒核酸. 2.试验材料 2.1引物 针对鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus IBV) 不同毒株基因序列差异区，分别设计针对BV的一对通用型引物 和检测GI-1谱系(Mass-like)、GI-13谱系(4/91-like)、GI-19谱 系(QX-like)和GI-22谱系(LDT3A-like)的4对特异性引物，详见 表1. 3 表1检测BV的通用型引物和不同谱系毒株的特异性引物 引物名称 序列(5-3) 扩增长度 用途 IBV-F ATGTCTATCGCCAGGGAAATGTC IBV-R 266bp IBV通用型 GCTCTAACTCTATACTAGCCTA 鉴定引物 Mass-F AGTTTCAATTGCTTACGGTCCT 360bp GI-1谱系(Mass-like) Mass-R AATAGCCAAACCTGCGTCT 鉴定引物 4/91-F AGTAGTTTTGTGTATAAACCA 328bp GI-13谱系(4/91-like) 4/91-R GAGTTAACACCAGTGGTTCACTT 鉴定引物 QX-F TGTATAAGGCAAGTGATTWTATG 340bp GI-19谱系(QX-like) QX-R ACTAAGGGCTCYGTTCTAGT 鉴定引物 LDT3-A-F TGCGCCACAGCAGGAAGAAT 787bp GI-22谱系(LDT3A-like) LDT3-A-R CGTAGTTGGAATGAAGAGA 鉴定引物 2.2阳性对照和阴性对照 阳性对照： GI-1谱系(Mass-like)代表毒株为鸡传染性支气管炎病毒 (H120株)，毒种编号为CVCC AV1514; GI-13谱系(4/91-like)代表毒株为鸡传染性支气管炎病毒 (IBV/CK/49101株)，毒种编号为CVCC AV1567; GI-19谱系(QX-like)代表毒株为鸡传染性支气管炎病毒 (IBV/CK/QX01株)，毒种编号为CVCC AV1568; GI-22谱系(LDT3A-like)代表毒株为鸡传染性支气管炎病毒 (IBV/CK/dt3a01株)，毒种编号为CVCC AV1569. 以上代表毒株均来源于国家兽医微生物菌（毒）种保藏中心. 阴性对照：生理盐水或无菌水. —4 2.3试剂 RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂、琼脂糖、50xTAE、DNA marker、无核酸酶水、生理盐水. 3.检测方法 3.1样品稀释 取疫苗按瓶签标示，用生理盐水稀释至每毫升至少含250羽 份；阳性对照按瓶签标示原倍或10倍稀释后使用. 3.2RNA提取 将稀释后的疫苗和阴、阳性对照按商品化核酸提取试剂盒进 行RNA核酸提取. 3.3RT-PCR反应 将3.2步骤提取的RNA进行反转录操作，按商品化的一步法 RT-PCR试剂盒说明书进行RT-PCR反应.RT-PCR反应程序如 下：第一阶段，反转录50℃30min;第二阶段，预变性92℃2min;第 三阶段，PCR扩增94℃30s 55℃30s 72℃1min 共30个循环，最 后...
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