SN/T 3989-2014 蜜蜂急性麻痹病检疫技术规范.pdf
文档页数：9文档大小：4.12MB文档格式：pdfSN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3989-2014 蜜蜂急性麻痹病检疫技术规范 Quarantine protocol for acute bee paralysis of honey bees 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布 SN/T3989-2014 蜜蜂急性麻痹病检疫技术规范 1范围 本标准规定了蜜蜂急性麻痹病的病原检测，包括病原透射电子显微镜观察RT-PCR方法、荧光 RT-PCR方法. 本标准适用于蜜蜂急性麻痹病的检疫. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. GB/T18088出人境动物检疫采样 3现场检疫 3.1蜂群检查 对待检的蜂群进行箱外观察，观察蜂群的行为是否异常、箱外是否有不正常的虫尸和有残翅的 幼蜂爬行等，从中把可疑有病的蜂群挑出来，进一步进行箱内检查 3.2箱内检查 提脾观察，主要查看箱内有无异常的拖弃物，蜜蜂是否有行为、形态等方面的异常.封盖是否异常， 巢脾上幼虫是否有病态表现及是否有死幼虫，幼虫或成年蜂身上是否携带有寄生物等. 3.3个体检查 抽检蜂箱内蜜蜂及巢门前的死蜂，拉出中肠检查是否有病变症状，若囊内充满蜜汁、中肠呈乳白色 并失去弹性、后肠积蓄黄褐色粪便则为疑似患蜜蜂急性麻痹病，及时把患病或疑似患病的蜂群撤离隔离 场，并采样送实验室进一步确诊. 4实验室诊断 4.1透射电子显微镜观察 4.1.1设备 透射电子显微镜（放大倍数：30万倍）、台式冷冻高速离心机、微量可调移液器(100μL~1000μL、 20gL~200L、2pL~20L、0.5L~10L)、水浴锅. 4.1.2材料和试剂 4.1.2.1PBS. 1 SN/T3989--2014 4.1.2.2三氯甲烷. 4.1.2.33%磷钨酸溶液. 4.1.2.4滤纸. 4.1.2.5洁净玻璃. 4.1.2.6铜网. 4.1.3样品采集 4.1.3.1成蜂样品的采集和保存 依据GB/T18088 现场检疫对有临床症状的蜂群，用灭菌后的镊子挑取蜂箱内巢脾上或蜂箱底部 带有典型病状的蜜蜂，以及在蜂箱前爬行的垂死蜜蜂和死亡蜜蜂20~30只，分别装入无菌的容器中，尽 快转移到液氮中保存，供检测用.无临床症状的蜂群，随机挑取箱内蜜蜂20~30只，分别装人无菌的容 器中，尽快转移到液氮中保存，供检测用. 4.1.3.2幼虫样品的采集和保存 依据GB/T18088 有临床症状的蜂群，无菌割取一小块带有病虫或死虫的巢脾（不小于20cm2)或无菌挑取单个病虫或死虫若干只装人无菌的小试管内，尽快转移到液氮中保存供检测用.无临床症 状的蜂群，随机无菌挑取幼虫若干只分别装入无菌的小试管内，尽快转移到液氮中保存，供检测用. 4.1.4样品处理 患病蜜蜂或幼虫3~5只，与2m1的PBS(pH7.6)混匀，充分研磨，再加人等量的三氯甲烷，匀浆 10min 然后5000r/min离心10min 取上清加入等体积的三氯甲烷，在37℃~40℃水浴中振摇 10min 5000r/min离心10min 上清继续用此法处理2~4次.取上清，15000r/min离心30min 取 上清，35000r/min离心1h 弃去上清，用适量PBS重悬沉淀即为病毒悬液. 4.1.5透射电镜观察 4.1.5.1取病毒悬液，滴一小滴于腊盘上.取铜网使有支持膜的表面与样品液表面接触，静置3...
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